Tiểu thư giang hồ là câu chuyện về cuộc đời của một cô gái trẻ tên Mary "Mia" Thermopolis (đóng bởi Anne Hathaway), người sống cùng mẹ đơn thân ở San Francisco. Cô không biết rằng mình thực sự là công chúa của một quốc gia nhỏ châu Âu gọi là Genovia. Khi bà ngoại của Mia, Nữ hoàng Clarisse Renaldi (đông bởi Julie Andrews), xuất hiện trong cuộc đời của cô, mọi thứ bắt đầu thay đổi chóng mặt. Bà tiết lộ cho Mia biết về danh tính thật sự của mình và yêu cầu cô tham gia vào các khóa học để trở thành một công chúa chính thức. Tuy nhiên, trước khi có thể tiếp nhận vai trò mới này, Mia phải đối mặt với những thách thức lớn. Ông bố của cô đã chết, nhưng di sản mà ông để lại vẫn còn đó. Và đặc biệt hơn cả, đó là việc cô phải rời xa môi trường quen thuộc và chuyển đến một ngôi trường nội trú nghiêm khắc tại New York. Tại đây, Mia gặp gỡ nhiều bạn bè mới và cũng phải đối mặt với những khó khăn trong việc hòa nhập với môi trường mới. Dưới sự hướng dẫn của bà ngoại, Mia dần dần trưởng thành và tìm hiểu thêm về bản thân cũng như vị trí của mình trong xã hội. Cuộc phiêu lưu của Mia từ một cô bé bình thường trở thành công chúa của Genovia là hành trình đầy màu sắc, thú vị và ý nghĩa. Qua đó, bộ phim muốn truyền tải thông điệp về tầm quan trọng của việc tự tin, kiên trì và chấp nhận thử thách để phát triển bản thân.